Manuel de travaux pratiques de biologie chimique et de biochimie utilisant l’expansion du code génétique Copyright © 2023 by eCampusOntario is licensed under a License Creative Commons Attribution - Pas d’utilisation commerciale 4.0 International, except where otherwise noted.
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Manuel de travaux pratiques de biologie chimique et de biochimie utilisant l’expansion du code génétique
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Manuel de travaux pratiques de biologie chimique et de biochimie utilisant l’expansion du code génétique, écrit par Ryan Mehl, Kari van Zee et Kelsey Keen, bénéficient d’une licence internationale Attribution − Pas d’utilisation commerciale 4.0 de Creative Commons, sauf indication contraire.
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Les protéines jouent un rôle essentiel dans la plupart des processus biologiques, notamment en tant que catalyseurs de réactions physiologiques, régulateurs de ces réactions ou cadre structurel autour duquel ces processus peuvent se produire. L’organisation complexe des diverses fonctionnalités des protéines dans l’espace 3D permet aux organismes vivants de disposer d’une surprenante gamme de fonctions. La compréhension de cette relation intime entre la structure et la fonction est au cœur de la compréhension du monde naturel et la clé de son contrôle.
La mutagenèse dirigée (le remplacement d’un codon d’acide aminé par un autre dans un gène) est un outil courant et pratique pour étudier la fonction des protéines. Cependant, malgré leur complexité fonctionnelle, les protéines ont une base structurelle assez simple : tous les organismes utilisent les mêmes 20 acides aminés pour construire les protéines, qui ont toutes une fonctionnalité chimique limitée (figure 1). Par conséquent, afin d’élargir la gamme d’études pouvant être réalisées sur les protéines, les acides aminés non canoniques (ou ncAA, aussi appelés acides aminés non naturels ou UAA), dont la fonctionnalité chimique est illimitée, sont des outils évidents pour étudier ces relations entre la structure et la fonction.
La manipulation des protéines pour permettre l’utilisation des ncAA exige l’exploitation du dogme central de la biologie moléculaire : la transcription d’une séquence d’ADN en ARNm et la traduction de cette séquence d’ARNm en une chaîne peptidique repliable et fonctionnelle. Un changement à l’ADN causera donc un changement dans la protéine. Cependant, la nature du code génétique, comportant plusieurs codons dégénérés spécifiant le même acide aminé, ne laisse pas de codons « inutilisés » permettant d’ajouter facilement des ncAA in vivo. Le codon doit donc être « détourné » pour pouvoir spécifier le ncAA en remplaçant un codon naturel dans une séquence. Le codon TAG, le moins utilisé des trois codons STOP, joue ce rôle et peut facilement remplacer n’importe quel codon existant dans une séquence grâce à la mutagenèse dirigée. Afin d’empêcher ce codon de signaler la fin de la chaîne peptidique, il doit fonctionner comme les autres codons « naturels » : une aminoacyl-ARNt synthétase (RS) doit lier un acide aminé à un ARNt personnalisé, qui ajoute ensuite l’acide aminé à la chaîne peptidique par l’intermédiaire du ribosome (figure 2). Étant donné que l’acide aminé n’est pas produit naturellement, il n’y a pas de paire RS/ARNt naturellement présente dans la cellule.
Pour faciliter l’incorporation spécifique du ncAA, la cellule doit donc disposer d’un ncAA-RS qui permet l’aminoacylation de l’ARNt couplé avec le ncAA uniquement, mais pas avec les acides aminés endogènes. Pour cela, il faut d’abord trouver dans la nature une RS et un ARNt utilisables par une cellule hôte (orthogonaux). Cette paire doit pouvoir fonctionner ensemble et avec le ribosome d’E. coli, et l’ARNt doit être capable de reconnaître le codon TAG de manière spécifique. Un nouveau ncAA non toxique peut être choisi pour les propriétés chimiques intéressantes qu’il peut introduire dans la protéine. Il faut ensuite sélectionner une RS capable de lier le ncAA pertinent lors de l’aminoacylation de l’ARNt. L’évolution dirigée des RS implique des cycles de sélection positive et négative sur une liste de RS (jusqu’à 108 membres), qui partagent toutes la même structure globale, mais présentent une variété de mutations concentrées autour du site de liaison de l’acide aminé. Les cycles de sélection positive consistent à transformer les membres de la liste en cellules contenant un plasmide avec le gène du chloramphénicol acétyl transférase (CAT), qui confère la résistance au chloramphénicol, contenant un codon TAG. Les cellules sont ensuite cultivées en présence du ncAA et de l’antibiotique chloramphénicol; les membres qui parviennent à incorporer le ncAA (ainsi que ceux qui incorporent des acides aminés endogènes) produisent une protéine CAT complètement fonctionnelle et peuvent survivre dans le milieu contenant du chloramphénicol. Pour exclure les membres restants qui ont utilisé un acide aminé endogène à la place du ncAA, un cycle de sélection négative est ensuite effectué. Les cycles de sélection négative consistent à isoler les plasmides contenant la RS des cellules ayant survécu à la sélection positive, puis à transformer les membres restants de la RS en cellules contenant un autre plasmide. Ce plasmide contient le gène toxique de la barnase avec un codon TAG en son milieu, qui encode une protéine toxique qui tue la cellule si elle est produite avec succès. Le ncAA est exclu du milieu dans les cycles de sélection négative, de sorte que les RS qui incorporent un acide aminé naturel en réponse au codon TAG ne survivent pas. Plusieurs cycles alternés de sélection positive et négative sont effectués jusqu’à ce que les RS restantes soient celles qui peuvent lier efficacement un ncAA à un ARNt (et donc produire une protéine contenant un codon TAG), mais qui ne peuvent pas lier un acide aminé naturel à cet ARNt.
Pour que la cellule produise la protéine TAG mutante et la paire ncAA-RS/ARNt nécessaire, il faut lui fournir les gènes qui les encodent. Les gènes sont introduits dans les cellules d’E. coli à l’aide des plasmides pBad et pDule (figure 3).
Le plasmide pBad contient le gène (lui-même contenant un codon TAG) qui encode la protéine pertinente contrôlée par un promoteur induit par l’arabinose, qui est une origine de la réplication, et un gène qui encode la bêta-lactamase (qui confère une résistance à l’ampicilline). Lorsqu’ils sont clonés dans le plasmide pBad, les codons pour 6 histidines sont ajoutés à la terminaison N ou C du gène, ce qui permet la purification par affinité de la protéine surexprimée. Le plasmide pDule contient les gènes qui encodent la ncAA-RS et l’ARNt(CUA), une origine de réplication (qui doit être compatible avec l’origine de réplication de pBAD) et un gène qui encode la protéine TetA (qui confère la résistance à la tétracycline). Ces plasmides doivent tous deux être transformés dans la cellule pour que la protéine de pleine longueur contenant le ncAA soit produite. Pour vérifier que les cellules contiennent les deux plasmides avant de commencer la surexpression, les cellules sont cultivées en présence des antibiotiques ampicilline et tétracycline, ce qui garantit que seules les cellules contenant les deux plasmides pourront se développer dans le milieu.
Les cellules contenant les plasmides adaptés peuvent ensuite être induites pour surexprimer la protéine pertinente à l’aide d’un milieu d’auto-induction à base d’arabinose. Le plasmide pBad contient un système promoteur d’arabinose qui active l’expression du gène sur ce plasmide en présence d’arabinose. Le milieu d’auto-induction est conçu pour permettre aux cellules d’atteindre une densité élevée avant que la surexpression soit induite, afin qu’un plus grand nombre de cellules soit disponible pour surexprimer la protéine lorsque l’induction commence. L’auto-induction du milieu est réalisée en utilisant des concentrations de sucre définies : lorsque les niveaux de glucose commencent à diminuer en raison du métabolisme cellulaire et de la croissance, les cellules commencent à absorber l’arabinose disponible. Bien qu’elles ne puissent pas le métaboliser pour poursuivre leur croissance, l’arabinose fonctionne comme un activateur du promoteur du plasmide pBad, induisant ainsi la surexpression de la protéine. L’électrophorèse sur gel des protéines brutes permet ensuite de vérifier facilement le succès de ce processus en contrôlant la taille de la protéine (de pleine longueur ou tronquée) produite en présence ou en l’absence de ncAA. La production d’une protéine de pleine longueur en présence d’un ncAA et d’une protéine tronquée en l’absence de ncAA indiquerait que le système ncAA-RS/ARNt(CUA) a été capable de reconnaître le codon TAG et d’incorporer le ncAA, mais pas les acides aminés endogènes.
La qualité d’une étude sur les protéines avec ncAA est définie par ce que l’on peut comprendre de la structure ou de la fonction de la protéine, ou par la nouvelle capacité conférée par la présence de ncAA dans la protéine. Étant donné que les ncAA élargissent le potentiel chimique limité des résidus d’acides aminés, une grande variété d’études et d’applications deviennent possibles pour explorer la nature à la fois sensible et résistante des protéines lorsqu’on utilise des ncAA. Selon l’emplacement et le type de substitution d’acide aminé, un large éventail d’effets sur la stabilité et/ou la fonction de la protéine peut se produire : les deux peuvent ne pas être touchées, la stabilité peut ne pas être touchée mais l’activité détruite, ou encore la protéine peut même ne pas se replier correctement, détruisant ainsi la fonction. Il a même été démontré que certains ncAA placés dans le site actif de l’enzyme améliorent la fonction de l’enzyme en modifiant l’électrostatique de la liaison ou de la catalyse. Si la stabilité et la fonction de la protéine ne semblent pas très perturbées par l’ajout du ncAA, les propriétés chimiques du ncAA peuvent être utilisées pour fournir des données pertinentes sur les états structurels de la protéine. Le tableau 1 présente des exemples de différents ncAA et d’études d’application.
Tableau 1. Quelques-unes des familles de ncAA et leurs applications.
Que la fonction de la protéine soit améliorée ou apparaisse plus clairement, ou que la structure et la dynamique de l’enzyme soient mieux comprises, l’utilisation des ncAA a permis de réaliser un plus grand nombre d’études sur les relations entre la structure et la fonction des protéines.
Catégorie de ncAA | Exemple de structure | Applications |
Photoréticulation | Aperçu des interactions entre protéines in vivo | |
Ligature bi-orthogonale | Conjugaison des fluorophores; fonctionnalisation de surface | |
Sondes d’évaluation de la taille et de la polarité | Altération du remplissage, de l’effet stérique et des autres interactions pour sonder les relations entre la structure et la fonction | |
Sonde du pH | Ajout, suppression et modification des interactions de liaison hydrogène pour étudier les relations entre la structure et la fonction | |
Réflexions approfondies sur les réflexions approfondies Tout au long de ce manuel, vous verrez des remarques intitulées « Réflexions approfondies » portant sur différents sujets. Elles ont été ajoutées pour vous aider à mieux comprendre votre projet et les techniques que vous utilisez, et pour vous fournir des éléments à prendre en compte lors de la conception de votre expérience, de l’analyse de vos résultats et de l’exécution des différentes étapes de ce laboratoire. Ces suggestions ne sont pas exhaustives; elles ont pour but de vous aider à réfléchir de manière critique à ce que vous faites et de guider votre conception et votre processus de réflexion. Nous nous attendons à ce que vous ayez lu, réfléchi et répondu à ces questions par vous-même avant de demander de l’aide à l’enseignant ou à l’assistant d’enseignement. |
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Semaine | Aperçu du calendrier provisoire des responsabilités du laboratoire Se reporter à l’autre calendrier pour les échéances spécifiques de remise des travaux |
1 | Effectuer une recherche documentaire sur l’enzyme, sa séquence génétique, les ncAA potentiels et les sites d’incorporation.
Les étudiants auront besoin de leurs ordinateurs portables pour effectuer une recherche documentaire sur l’enzyme, sa séquence génétique, les ncAA potentiels et les sites d’incorporation. · Télécharger et étudier la structure cristalline de l’enzyme. · Examiner les ncAA et les sites qui seront étudiés tout au long du semestre. Afin d’éviter la congestion dans l’utilisation du matériel pour les dosages cinétiques, trois groupes dans chaque section ont été assignés à l’anhydrase carbonique et trois groupes à la catalase. |
2 | Exprimer la protéine de type sauvage et continuer à élaborer l’hypothèse et à planifier les expériences
· Mélanger le milieu à auto-induction et obtenir les cellules d’E. coli avec les plasmides d’expression adaptée pour que le processus d’expression de la protéine de type sauvage commence dans la nuit. · Élaborer une hypothèse expérimentale sur la base des ncAA et des sites que votre équipe a choisi d’étudier. · Indiquer au professeur, avant le jeudi de la semaine 2 à 17 h, quels sont les sites protéiques et les ncAA qui seront exprimés, afin que les cultures de départ puissent être préparées pour la 3e semaine du cours. · Commencer une recherche documentaire sur les procédures de dosage. · Récolter les cellules 48 heures après l’induction et les conserver à -80 °C. Préparer les solutions SDS-PAGE. · Analyser la production de protéine de type sauvage par SDS-PAGE brute. |
3 | Exprimer les protéines mutantes ncAA et les protéines de type sauvage, purifier les protéines de type sauvage et continuer d’élaborer les dosages.
· Mélanger le milieu à auto-induction et obtenir les cellules d’E. coli avec les plasmides d’expression adaptée pour que le processus d’expression de protéines mutantes ncAA de type sauvage commence dans la nuit. · Préparer les tampons de purification des protéines. · Se familiariser avec la procédure de dosage. · Éliminer les cellules d’E. coli pour purifier la protéine de type sauvage. · Créer les tampons de dosage ou de stockage. · Dessaler les protéines de type sauvage dans le tampon de dosage ou de stockage. · Récolter les cellules 48 heures après l’induction et les conserver à -80 °C. · Analyser la production de protéines mutantes ncAA par SDS-PAGE brute. |
4 | Purification des protéines mutantes ncAA et évaluation préalable des protéines de type sauvage.
· Analyser les protéines de type sauvage purifiées par SDS-PAGE. · Déterminer le taux de concentration en protéines. · Déterminer si la protéine pure est active. · Purifier les protéines mutantes ncAA des cellules. |
5 | Dosage cinétique préalable des protéines de type sauvage et évaluation préalable des protéines mutantes ncAA purifiées.
· Commencer les essais de dosage cinétique préalables avec les protéines de type sauvage. · Analyser les protéines mutantes ncAA purifiées par SDS-PAGE. · Déterminer le taux de concentration en protéine. · Déterminer si la protéine pure est active. |
6 à 9 | Continuer à concevoir et appliquer les études sur les protéines pures, notamment en testant les protéines de type sauvage et les protéines mutantes ncAA à l’aide de dosages cinétiques. |
10 | Nettoyer le laboratoire et faire les présentations par section du laboratoire.
· Le travail final et les carnets de notes doivent être rendus le lundi de la semaine des examens finaux à 16 h. |
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Votre objectif est de concevoir une étude scientifique significative autour de l’un des enzymes qui ont été choisis pour vous : l’anhydrase carbonique II humaine thermostable ou la catalase HPII d’E. coli. Traditionnellement, les biochimistes peuvent remplacer n’importe quel acide aminé d’une protéine par n’importe quel autre acide aminé naturel grâce à des méthodes de mutagenèse standard. Cette méthode est courante pour faciliter la compréhension du fonctionnement d’une protéine (régulation, liaison, etc.) et pour améliorer son utilité pour d’autres applications (stabilité, activité, etc.). Nous allons rompre avec cette tradition et vous permettre de sélectionner de nouvelles structures d’acides aminés (acides aminés non canoniques) pour étudier les protéines d’une manière qui n’était pas possible auparavant. Il serait possible de placer les ncAA n’importe où dans la protéine au moyen de l’expansion du code génétique, mais en raison des contraintes de temps de la mutagenèse, nous sommes obligés de ne sélectionner que certains sites pour que vous puissiez les explorer. La clé de cette activité est de déterminer ce qui est important dans les sites que nous avons sélectionnés pour vous en termes de stabilité, d’activité, de régulation des protéines ,etc., puis de choisir parmi les nouvelles capacités chimiques des ncAA pour développer une étude scientifique significative qui n’a jamais été possible auparavant.
En utilisant la liste des sites de mutation et des ncAA disponibles fournie par l’enseignant (annexe 6), choisissez un ou deux sites à explorer par l’incorporation des ncAA. Vous serez en mesure de produire deux nouvelles protéines mutantes à étudier en parallèle de la protéine de type sauvage. Une recherche documentaire sur votre enzyme spécifique peut mettre en évidence des résidus particuliers dans cette enzyme qui sont censés influer sur la structure ou la fonction de la protéine. Examinez attentivement les propriétés chimiques (c.-à-d. la chaîne latérale de l’acide aminé de type sauvage) qui existent déjà dans les sites et les nouvelles propriétés qui peuvent être introduites par les ncAA. Le site peut-il être un facteur dans la catalyse de l’enzyme? Est-il responsable du maintien des caractéristiques structurelles de la protéine ou participe-t-il à la transmission des changements structurels à différentes zones de la protéine? Il s’agit d’aspects importants à prendre en compte lors de la sélection des sites et des ncAA qui seront étudiés pendant toute la durée du semestre. Votre étude doit s’inscrire dans le contexte de la littérature scientifique.
Pour faciliter la production et la purification des protéines mutantes ncAA choisies, les gènes pertinents – la variante thermostable de l’anhydrase carbonique II humaine (CA) et la catalase HPII (HPII) d’E. coli – ont été synthétisés commercialement pour optimiser leur utilisation des codons pour l’expression dans E. coli. Les deux gènes ont été clonés dans le plasmide d’expression pBad. Le clonage supprime le codon STOP et ajoute une étiquette d’affinité riche en histidine à la terminaison C, ce qui permet de purifier facilement le produit protéique. Un codon STOP (TAG) a ensuite été incorporé à la place d’un codon dans le gène de type sauvage en utilisant des amorces mutées. Ces deux plasmides, l’un contenant le gène de type sauvage et l’autre la mutation TAG, permettront de produire respectivement une version de type sauvage et une version mutante ncAA de la protéine. Chaque groupe effectuera des études comparatives de la structure et de la fonction de l’ensemble des protéines pures, de type sauvage et mutante ncAA. Les séquences génétiques pertinentes pour chaque protéine se trouvent dans les tableaux correspondants de l’annexe 2 et les structures ncAA disponibles se trouvent à l’annexe 3. En utilisant ces séquences génétiques, il est possible de faire une estimation du poids moléculaire et de la séquence du produit protéique à l’aide de la ressource Web fournie. Ces données seront utiles pour les étapes ultérieures du processus de purification.
Réflexions approfondies : Structure des acides aminés Pensez aux caractéristiques des acides aminés naturels que vous allez remplacer. On classe généralement les acides aminés naturels dans un certain nombre de catégories différentes : hydrophobes, hydrophiles, polaires, non polaires, chargés (négatifs ou positifs), non chargés, acides, basiques, aromatiques, aliphatiques (la liste est encore longue). Les acides aminés non canoniques ou non naturels peuvent être classés dans des catégories encore plus complexes et appartiennent souvent à plusieurs catégories différentes à la fois (par exemple, l’acide 4-bromophénylalanine est un acide aminé aromatique possédant un substitut halogène, ce qui permet des interactions électrostatiques que l’on ne trouve pas dans la nature). Il est important de comparer les caractéristiques de l’acide aminé naturel à celles de l’acide aminé non canonique par lequel vous allez le remplacer. Sont-ils tous les deux hydrophobiques? Aromatiques? Chargés? Aromatiques et chargés? Si les caractéristiques sont différentes, comment cela affectera-t-il la structure et/ou la fonction de votre protéine? Si les caractéristiques sont similaires, le ncAA pourra-t-il maintenir la structure et/ou la fonction de votre protéine? Une autre caractéristique importante de chaque acide aminé qu’il est important de prendre en compte (toujours en lien avec les relations entre structure et fonction) est la liaison hydrogène. Les liaisons hydrogène sont essentielles à la cohésion des protéines et vous devez vous demander quel impact votre nouvel acide aminé aura sur les interactions de liaison hydrogène. Votre acide aminé naturel est-il impliqué dans des liaisons hydrogène? Votre nouvel acide aminé non canonique peut-il participer à ces mêmes liaisons hydrogène? Il est possible qu’il ne puisse pas en former ou qu’il puisse en former de nouvelles. Ce n’est pas parce que deux éléments sont proches l’un de l’autre qu’il y aura forcément une liaison hydrogène! Vous devez tenir compte non seulement de la distance et de la proximité, mais aussi de la géométrie et de l’environnement de la liaison hydrogène (autres liaisons hydrogène, rôle de donateur ou de receveur, etc.) L’hydrophobie joue également un rôle dans ce raisonnement. La création de nouvelles liaisons hydrogène s’est avérée être une stratégie efficace pour améliorer la thermostabilité, comme dans le cas de l’anhydrase carbonique humaine. Et comme nous utilisons des acides aminés non canoniques, encore plus de liaisons sont possibles! |
Matériel nécessaire (à obtenir pour la semaine 2)
Équipement
Préparation de cultures (la composition des milieux sera préparée et aliquotée par les assistants d’enseignement)
Ressources et protocoles suggérés
HAMMILL, J.T., S. MIYAKE-STONER, J.L. HAZEN, J.C. JACKSON, R.A. MEHL. Preparation of site-specifically labeled fluorinated proteins for 19F-NMR structural characterization, 2007, Nature Protocols, vol. 2 no 10, p. 2 601 à 2 607.
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Avant la fin de journée du jeudi de la semaine 2 :
Réflexions approfondies sur le savoir-être en laboratoire Maintenant que vous vous lancez dans la composante expérimentale de ce cours, il est important de prendre conscience des règles de savoir-être en laboratoire à adopter. Vous travaillez dans un espace de laboratoire partagé avec de nombreux autres étudiants, dont votre groupe de laboratoire, mais aussi les autres groupes de laboratoire de votre classe ET les groupes de laboratoire des autres sections, dont certains utilisent la même paillasse que vous. Vous devez tenir compte de toutes ces personnes ainsi que des enseignants et des assistants d’enseignement lorsque vous travaillez dans le laboratoire. Cela représente beaucoup de gens! Voici quelques recommandations : · Nettoyez après votre passage. Nettoyez votre paillasse et toutes les zones communes du laboratoire immédiatement après les avoir utilisées (cela comprend le nettoyage de la zone de pesée, le remplissage des boîtes d’embouts de pipettes, etc.) · Faites preuve de courtoisie et de respect. Respectez les membres de votre groupe et les autres personnes présentes dans le laboratoire. Respectez les affaires des autres; n’utilisez pas ni n’interférez avec les expériences ou les réactifs de quelqu’un d’autre. · Préparez-vous. On attend de vous que vos préparations soient faites avant la journée au laboratoire. Élaborez un plan à l’avance pour savoir ce que votre groupe souhaite accomplir en laboratoire et comment vous comptez vous y prendre pour y parvenir. Vous disposez d’un temps limité pour travailler en laboratoire. Le fait d’arriver avec un plan déjà prêt est non seulement respectueux pour les autres membres de votre groupe et les enseignants, mais vous aidera également à travailler de manière efficace. · Utilisez les ressources du laboratoire à bon escient. Les réactifs et les fournitures sont dispendieux et vos frais de laboratoire ne couvrent qu’une partie des coûts de fonctionnement de ce laboratoire réservé aux projets. · Utilisez des étiquettes. Toutes vos fournitures doivent être correctement étiquetées avec le nom de votre groupe et leur contenu. Cela permet non seulement d’aider les autres membres du groupe à trouver les réactifs nécessaires, mais aussi d’éviter les risques et les problèmes liés à la manipulation de réactifs inconnus en cas de déversement ou de nettoyage. · Faites preuve de ponctualité. Tout comme vous arriveriez à l’heure pour un cours magistral, on attend de vous que vous arriviez à l’heure et que vous soyez prêt à travailler dès le début du cours. · Faites preuve de prudence. Respectez toutes les procédures de sécurité adaptées et posez des questions si vous en avez. |
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Les protéines appropriées seront produites en faisant croître des cultures de cellules d’E. coli DH10B, qui contiennent différents plasmides utilisés en fonction de la capacité requise. Pour s’assurer que seules les cellules contenant les plasmides appropriés peuvent croître dans le milieu, elles doivent être cultivées en présence d’antibiotiques. La protéine de type sauvage sera produite à partir d’un plasmide pBad (pBad-gène), et les cellules contenant pBad doivent être cultivées en présence d’ampicilline. La protéine ncAA-mutante sera également produite à partir d’un plasmide pBad, qui contient le même gène mais avec un site TAG à l’un des codons (pBad-TAG-gène). De plus, pour produire des protéines avec des acides aminés non canoniques, il faut également ajouter une machinerie de traduction non naturelle. Cette machinerie non naturelle se trouve sur le plasmide pDule-RS, et les cellules contenant pDule doivent être cultivées en présence de tétracycline. En outre, l’acide aminé non canonique doit être ajouté dans le milieu parce que les cellules d’E. coli ne produisent pas naturellement les ncAA. Par conséquent, alors que les cellules productrices de protéines de type sauvage ne doivent être cultivées qu’en présence d’ampicilline pour produire des protéines de type sauvage, les cellules productrices de protéines mutantes ncAA devront être cultivées avec de l’ampicilline, de la tétracycline et l’acide aminé non canonique dans le milieu afin de produire la protéine mutante ncAA.
En tant que contrôle supplémentaire pour la surveillance de la production des protéines, l’expression de contrôles négatifs doit être exécutée pour chaque type de ncAA utilisé. Ces expressions permettent de s’assurer qu’aucun acide aminé naturel n’est utilisé par la synthétase et inséré dans le site TAG. L’expression des contrôles négatifs se fait en l’absence de ncAA dans le milieu; par conséquent, seules des protéines tronquées devraient être produites par ces expressions. En tant que contrôle positif pour votre média, vous exprimerez des cultures de 5 ml de la protéine fluorescente verte superfolder (sfGFP). Ces cellules contiendront uniquement le plasmide pBad-sfGFP (amp seulement) et deviendront vertes si le milieu a été préparé correctement.
Après environ 24 à 48 heures d’expression, les cultures cellulaires de grand volume devraient être saturées avec des cellules qui ont été induites pour surexprimer la protéine d’intérêt. La séparation des cellules du milieu et le stockage des culots cellulaires à -80 °C une fois l’expression terminée permettront de purifier ultérieurement la protéine à partir des cellules.
Remarque : Cette année, nous réalisons séparément l’expression et la purification des protéines de type sauvage et des protéines mutantes ncAA pour vous permettre de passer plus de temps à comprendre votre protéine et à développer une hypothèse expérimentale. Les équipes vont simplement faire pousser des cultures de leur protéine de type sauvage et d’un contrôle sfGFP pendant la semaine 2, puis l’ensemble des protéines de type sauvage et mutantes ncAA pendant la semaine 3. Dimensionner les composants du milieu de manière appropriée.
N’oubliez pas que ces instructions pour les volumes à préparer sont des lignes directrices : assurez-vous de comprendre les principes et de pouvoir ajuster la quantité de milieux que vous préparez et le volume de cultures que vous cultivez de manière adéquate. Ne préparez pas plus de milieux que nécessaire pour l’expression de cette semaine.
Matériel nécessaire
Équipement pour expression en cultures de 50 ml
Préparation des cultures :
Ressources et protocoles suggérés
Hammill, J.T.; Miyake-Stoner, S.; Hazen, J.L.; Jackson, J.C; Mehl, R.A. (2007) Preparation of site-specifically labeled fluorinated proteins for 19F-NMR structural characterization. Nature Protocols, vol. 2 no 10, p. 2 601 à 2 607.
Réflexions approfondies sur l’exploitation du dogme central Les détails de base de l’expansion du code génétique sont indiqués dans la partie « Contexte » de ce manuel de laboratoire. Le but de l’expansion du code génétique est d’incorporer un acide aminé non canonique dans un site spécifique dans une protéine de votre choix. Comment ça marche exactement? Comment le code génétique est-il facilité par l’ARNt? Qu’est-ce que l’anticodon sur l’ARNt orthogonal? Où dans la protéine votre acide aminé non canonique est-il incorporé? L’expansion du code génétique nécessite au moins quatre composants différents. Quelles sont ces composants? Où doivent-ils être? Comment sont fabriqués ces composants? Que se passerait-il si l’un de ces composants manquait? Par exemple, que se passerait-il si l’acide aminé non canonique n’était pas ajouté dans vos milieux? Ou si la synthétase de l’ARNt orthogonal était manquante ou si une synthétase d’ARNt orthogonal incompatible était ajoutée? Réfléchir à ces questions peut également vous aider à résoudre vos problèmes d’expression si les choses ne semblent pas se passer comme prévu. |
Le manuel Bio-Rad Mini Protean Tetra Cell (en particulier la section 4.2) contient des protocoles pour la fabrication de solutions mères pour les gels et tampons pour la SDS-PAGE en Laemmli discontinu).
Réflexions approfondies sur la technique stérile Le maintien d’une technique stérile est un élément clé du travail avec E. coli et la biologie moléculaire en général. Vous voulez que votre E. coli puisse pousser, et rien d’autre. Mais les germes sont partout! Et qu’est-ce qui ne voudrait pas pousser dans un bouillon agréable, chaud et aéré riche en nutriments? Afin d’empêcher d’autres choses de croître, nous utilisons la technique stérile (c.-à-d. tuer tout ce que nous ne voulons pas avec la chaleur ou l’éthanol). Pratiquer une bonne technique stérile vous aidera avant tout dans le cadre du laboratoire. Mais au-delà de ce cours de laboratoire, la technique stérile peut s’avérer utile pour vous. Considérez n’importe quel type de pratique médicale, que vous soyez pré-médecine, pré-dentaire, ou quelqu’un qui visitera probablement un médecin à un moment de sa vie, la technique stérile limite la propagation des agents pathogènes et réduit vos chances de développer une maladie nocive. Réfléchissez soigneusement à la façon d’organiser votre espace de travail et vos outils pour maintenir la stérilité. |
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Préparation du milieu d’auto-induction : Le milieu doit être préparé avec les solutions stériles et l’équipement stérile obtenus à la semaine 1.
CONSEIL : Toutes ces étapes doivent être effectuées en utilisant une technique stérile avec une flamme allumée. Les pipettes et la paillasse doivent être nettoyées avec de l’eau et de l’éthanol avant de commencer. Assurez-vous d’utiliser uniquement des embouts, des fioles, des pipettes, de l’eau et des milieux stériles.
Préparation du milieu d’auto-induction pour l’expression (100 ml). Mettez à l’échelle pour obtenir la quantité dont vous avez besoin pour votre expérience en fonction des quantités suivantes pour 100 ml. Préparez un mélange frais et ne prévoyez pas de stocker le milieu auto-inductif (MAI) en excès.
Aspartate (5 %, pH 7,5) 5 ml
Glycérol (10 %) 5 ml
Sels minéraux 25x 4 ml
Glucose (40 %) 0,125 ml
MgSO4 (1 M) 0,2 ml
Arabinose (20 %) 0,25 ml
Métaux traces (5 000x) 20 µl
Mélange de 18 AA (25x) conservé à 4 °C 4 ml
Ajoutez les antibiotiques appropriés (ampicilline à une concentration finale de 100 µg/ml et tétracycline à 25 µg/ml).
Ajoutez de l’eau stérile pour obtenir un volume final de 100 ml.
Volumes et fioles recommandés pour les expressions pendant les semaines 2 et 3:
Protéine de type sauvage 75 ml Expression en fiole de 250 ml
Protéine ncAA 1 75 ml Expression en fiole de 250 ml
Protéine ncAA 1 (contrôle négatif -ncAA) 5 ml Expression en tube à culture
Protéine ncAA 2 75 ml Expression en fiole de 250 ml
Protéine ncAA 2 (contrôle négatif -ncAA) 5 ml Expression en tube à culture
Contrôle sfGFP sauvage (-ncAA) 5 ml Expression en tube à culture
CONSEIL (EXEMPLE POUR 250 ml — METTEZ À L’ÉCHELLE SELON VOS BESOINS): Il est pratique de commencer avec une bouteille de 250 ml d’eau stérile et d’en retirer environ 50 ml en les plaçant dans un autre récipient stérile (pour une utilisation ultérieure). Ensuite, tous les composants du milieu peuvent être ajoutés à 200 ml d’eau stérile et complétés avec de l’eau stérile à un volume final de 250 ml. Ensuite, ajoutez 250 microlitres d’ampicilline à 100 mg/ml au milieu, puis placez 75 ml de celui-ci dans une fiole avec déflecteur de 250 ml pour l’expression des protéines de type sauvage. 175 microlitres de tétracycline à 25 mg/ml peuvent ensuite être ajoutés au milieu restant (175 ml), qui peut ensuite être réparti dans les fioles d’expression. Les ncAA seront ajoutés plus tard.
Chaque section de laboratoire doit utiliser le code couleur de ruban approprié pour étiqueter les fioles afin qu’il soit facile de les récupérer. Rappelez-vous qu’il y a 4 sections et plus de 80 étudiants et, certaines semaines, 80 à 100 fioles en activité.
Ajout de cellules provenant de cultures de départ :
Dans les fioles préparées (75 ml de milieu par fiole), ajoutez des cultures cellulaires saturées en milieu non inductif de la lignée cellulaire appropriée pour commencer les expressions. Diluez les cellules appropriées issues des cultures de départ de la nuit du 1/100e au 1/200e dans chaque fiole contenant 75 ml. Incubez ces cultures pendant 0,5 à 1 heure avant d’ajouter les ncAA (cette incubation peut être raccourcie pour certains ncAA).
Préparation et ajout des ncAA (semaine 3) :
La concentration recommandée pour les ncAA est une concentration finale dans le milieu d’expression > 1 mM. Les ncAA peuvent avoir besoin d’aide pour se dissoudre avant de les ajouter au milieu, selon les caractéristiques chimiques du ncAA. Il est recommandé de peser légèrement plus que la quantité appropriée de ncAA directement dans un microtube à centrifugation. Commencez par ajouter 0,5 ml d’eau stérile et mélangez – si le ncAA se dissout, ajoutez-le à la fiole d’expression appropriée. Si la majeure partie du ncAA se dissout, essayez d’abord d’ajouter 0,5 ml d’eau stérile. Si très peu de ncAA se dissout après le premier 1 ml, essayez d’ajouter 1 équivalent molaire de NaOH à partir de la solution mère à 8 M (ajoutez 5 µl de NaOH à 8 N à la fois et ne dépassez pas 20 µl au total). Trop de NaOH peut endommager certains des ncAA et causer des problèmes de croissance cellulaire. Une fois que les ncAA sont ajoutés à leurs fioles appropriées, laissez-les incuber tout en les agitant à 250-300 tours/minute à 37 °C jusqu’à 48 heures (cette longue incubation est conçue pour respecter l’horaire de BB 494; les cultures sont généralement cultivées pendant 24 à 40 heures avant la récolte).
Pour obtenir un point de temps zéro d’expression protéique, retirez 250 microlitres des cultures cellulaires de départ d’origine en milieu non inductif et centrifugez entre 3 000 et 5 000 rcf pendant 5 à 10 min. Jetez le surnageant et entreposez le petit culot cellulaire à -20 °C dans votre congélateur (étiquetez bien tous les échantillons afin que vous et vos partenaires puissiez bien les identifier à l’avenir).
Exprimez la protéine pendant 24 à 48 heures. Avant de récolter les cellules par centrifugation, n’oubliez pas de retirer d’abord 250 cellules microlitres pour les derniers points de temps pour un gel brut. Déterminez également la densité (OD600) des cultures. Divisez chaque échantillon de cellules en aliquotes de 25 à 35 ml dans des tubes coniques pré-pesés. Faites tourner les cellules dans des tubes coniques de 50 ml pendant 10 min entre 5 000 et 8 000 rcf dans la centrifugeuse de la paillasse (pas la Sorvall). Retirez le surnageant en le versant, déterminez la masse de chaque culot cellulaire et conservez les culots cellulaires à -80 °C. Encore une fois, indiquez bien la section, le numéro de groupe, la date et l’échantillon sur les tubes. Conservez les culots cellulaires dans de petits sacs à fermeture à glissière bien étiquetés au stylo directement sur le sac, indiquant votre section de laboratoire, votre numéro de groupe et la date. N’utilisez pas de ruban adhésif pour étiqueter les tubes ni les sacs : il tombera à -80 °C.
Réflexions approfondies sur les souches bactériennes et les plasmides Nous vous fournissons des cultures de départ cultivées dans des milieux non inductifs avec lesquels inoculer vos plus grandes cultures, mais qu’utilisez-vous exactement? Prenez-vous aveuglément ce que l’assistant ou l’enseignant vous donne en suivant les instructions pour exprimer les protéines dans ce manuel ou savez-vous comment fonctionne le système et ce que contient exactement cette culture de départ? Si vous ajoutez des antibiotiques à votre milieu, pourquoi? Comment savoir quels sont les bons antibiotiques? Toutes vos expressions n’utilisent pas les mêmes antibiotiques, pourquoi? Comment se transmet la résistance à ces antibiotiques? Il existe une grande variété de souches bactériennes différentes que nous pourrions utiliser, chacune présentant des caractéristiques uniques optimisées pour des objectifs précis et présentant des avantages et des inconvénients. Certaines sont conçues pour contrôler étroitement l’expression et sont utilisées pour exprimer des protéines qui peuvent être toxiques pour une cellule. D’autres manquent ou contiennent des mutants de certains gènes afin de prévenir la dégradation des protéines, de favoriser la formation de liaisons disulfure ou de limiter la production de certains métabolites. Quelle souche bactérienne utilisez-vous? Quels sont certains de ses avantages et inconvénients? À votre avis, pourquoi a-t-on choisi cette souche pour ces expériences? En raison des contraintes de temps de ce cours, les bactéries contenant les plasmides appropriés vous ont également été fournies. Ce n’est pas parce que vous n’avez pas réalisé cette partie de l’expérience vous-même que vous devez ignorer comment cette étape a été réalisée. Comment ces plasmides ont-ils été générés? Que contient chacun des plasmides? Comment ces plasmides sont-ils entrés dans la bactérie où votre protéine d’intérêt peut être surexprimée? À tout le moins, vous voudrez connaître et comprendre : le type d’E.coli que vous utilisez, les plasmides que vous utilisez et ce qui est codé sur chacun de ces plasmides. |
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Avant d’analyser des échantillons de protéines par électrophorèse sur gel, il est utile de connaître la position prévue des bandes sur le gel en calculant la taille prévue de la protéine. Le chapitre 6 de Voet et Voet décrit les principes de base de SDS-PAGE. Connaître la taille prévue des bandes est également important lors de la sélection de la concentration de polyacrylamide que le gel doit contenir, puisque différents niveaux de polyacrylamide sont plus efficaces pour séparer différents intervalles de tailles de protéines. Les sources Molecular Cloning (qui traitent également de la coloration utilisée dans ce processus, Coomassie G-250) et le manuel Bio-Rad sont également de bonnes ressources pour les principes de l’électrophorèse sur gel.
Réflexions approfondies sur les contrôles À quoi sert un contrôle? Généralement, un contrôle peut être utilisé pour vérifier que votre système se comporte comme vous l’attendez. De plus, un contrôle peut être utilisé pour déterminer ce qui se passe lorsque quelque chose ne va pas dans votre expérience, le cas échéant, et le corriger. Dans ce travail pratique, vous serez amené à utiliser des contrôles dans au moins deux contextes : l’expression des protéines (pour l’incorporation de ncAA) et les dosages. Y a-t-il d’autres contrôles que vous devriez intégrer à vos expériences? Pour l’expression de votre protéine, vous devez mettre en place des contrôles positifs et négatifs. Que sont ces contrôles? Quels résultats espérez-vous observer pour vos contrôles positifs et négatifs? Si vos contrôles s’éloignent de cette attente, qu’est-ce qui l’explique? Avez-vous besoin de contrôles de purification? Pour votre dosage, un contrôle est un moyen important de vérifier que l’activité observée provient de votre protéine et non d’une autre source. Comment mettre en place ce contrôle? Ce n’est pas grave si une certaine activité est observée lors de votre contrôle (on l’appelle couramment « réaction de base »). Dans un tel cas, comment pourriez-vous utiliser les résultats de ce contrôle? |
Matériel nécessaire pour SDS-PAGE
Équipement
SDS-PAGE – voir le guide Bio-Rad SDS-PAGE pour les gels en Laemmli discontinus du système Mini Protean II
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Pour préparer les échantillons d’extrait brut pour l’électrophorèse sur gel, prenez d’abord les culots cellulaires de 250 µl qui ont été conservés à -20 °C. Resuspendez les culots dans 50 µl de H2O distillée – pipetez de haut en bas et passez au vortex pour remettre en suspension la totalité du culot cellulaire. Ajoutez ensuite 50 µl de colorant SDS 2x. Assurez-vous que le colorant SDS est complètement dissous avant de l’ajouter aux échantillons, car le SDS précipite hors de la solution à basse température. Chauffer les échantillons à 100 °C pendant environ 5 à 10 minutes, en les passant au vortex au besoin pour assurer une dissolution complète. Centrifuger les échantillons à >10 000 rcf pendant 5 minutes. Une fois le gel préparé comme indiqué dans le protocole d’instructions, 20 µl du surnageant peuvent être placés dans chaque cavité du gel de polyacrylamide. N’oubliez pas d’ajouter 5 µl de marqueurs de poids moléculaire dans une cavité.
Pour effectuer l’expérience, suivez le protocole d’instructions Bio-Rad Protean II. Une fois que le front de colorant a atteint le fond du gel, coupez la tension et retirez le gel des plaques de verre. Placez le gel dans la solution de coloration bleu de Coomassie brillant G-250 dans un récipient en plastique et agitez pendant plusieurs heures (ou suivez le conseil ci-dessous). La solution de coloration peut ensuite être versée et le décolorant versé sur le gel, en agitant encore par la suite. Le décolorant peut être versé dans le conteneur à déchets prévu à cet effet sous la hotte et remplacé plusieurs fois jusqu’à ce que les bandes soient clairement visibles sur le fond du gel.
Matériel nécessaire pour la purification de la protéine de résine TALON
Préparation du tampon de purification et composants
Ressources et protocoles suggérés
Le manuel Bio-Rad Mini Protean Tetra Cell (en particulier la section 4.2) contient des protocoles pour la fabrication de solutions mères pour les gels et tampons pour la SDS-PAGE en Laemmli discontinu).
Voet et Voet
Sambroo’s Molecular Cloning: A Laboratory Manual
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La queue polyhistidine permet une purification de la protéine d’intérêt à partir d’autres protéines à l’aide d’une résine d’affinité métallique. Il est important d’utiliser la bonne quantité de résine : une trop grande quantité peut se lier sans discernement à des protéines dépourvues de queue polyhistidine, ce qui donne des protéines impures, tandis qu’une quantité insuffisante entraîne la perte d’une partie de la protéine souhaitée lorsque la résine est surchargée, ce qui réduit le rendement.
Le tampon d’élution utilisé pour éluer la protéine marquée à la polyhistidine au cours de la procédure de purification (contenant du phosphate de sodium, du chlorure de sodium et de l’imidazole) n’est probablement pas un tampon optimal pour vos dosages. Par conséquent, la protéine doit être retirée du tampon d’élution et placée dans un tampon de stockage ou de dosage. Le concept de la méthode de purification utilisée pour dessaler les échantillons de protéines – la chromatographie par filtration sur gel – est important à comprendre. Ses principes sont décrits au chapitre 5 de Mathews, Van Holde, Appling et Athony-Cahill ou au chapitre 6 de Voet et Voet.
Réflexions approfondies sur les tampons Vous avez passé beaucoup de temps à en apprendre sur les tampons et le pH en classe depuis l’école secondaire. Mais vous souvenez-vous de ce qu’est un tampon et de sa fonction? Si ce n’est pas le cas, peut-être voudrez-vous revoir le tout avant de continuer. Vous avez déjà utilisé et créé une variété de tampons, mais qu’est-ce qui fait un bon tampon? Par exemple, les tampons pour la purification par SDS-PAGE et par affinité polyhistidine ont prescrit des recettes optimisées pour chaque objectif précis. Maintenant, c’est à vous de sélectionner et de créer vos propres tampons pour vos expériences. À tout le moins, vous devrez sélectionner un tampon adapté au stockage de vos protéines à dessaler. Dans ce cas, qu’est-ce qui constitue un bon tampon? Ça dépend des qualités que vous souhaitez dans votre tampon. Dans ce cas, vous voulez probablement un tampon dans lequel votre protéine est stable. Afin d’éviter de changer à nouveau les tampons, vous souhaiterez probablement également un tampon qui n’interférera pas avec le dosage de votre choix. Il peut y avoir des qualités supplémentaires à prendre en compte lors du choix et de la fabrication de votre tampon. |
Réflexions approfondies sur la purification des protéines Les protéines peuvent être purifiées de différentes manières. Dans ce cours, nous utilisons l’une des méthodes les plus simples et les plus courantes pour purifier les protéines exprimées par recombinaison : la purification par affinité avec la polyhistidine. Comment cette méthode fonctionne-t-elle réellement? De quoi dépend-elle pour fonctionner efficacement? Si vous rencontrez des problèmes avec votre système de purification, quel pourrait être le problème et comment le résoudre? De nombreuses techniques de purification autres que la purification par affinité avec la polyhistidine peuvent être utilisées. Elles s’appuient sur la taille, la charge ou l’affinité d’autres molécules comme technique de purification de substitution ou en complément de la purification par affinité avec la polyhistidine, afin d’obtenir un échantillon plus pur. Quelles sont ces techniques? Quelles sont les conditions requises pour purifier efficacement votre protéine d’intérêt et quels sont les avantages et les inconvénients de leur utilisation? |
Matériel nécessaire
Équipement
Purification et dessalage des protéines
Ressources et protocoles suggérés
http://www6.gelifesciences.com. (lien inactif au 19/5/2021) Sélectionnez un tampon pour le dessalage qui soit compatible avec vos dosages. Assurez-vous de bien comprendre le concept général et l’utilisation des termes « tampon d’équilibrage » et « tampon d’élution ».
Réflexions approfondies sur la stabilité des protéines La stabilité des protéines est applicable à ce cours de multiples façons. Tout d’abord, vous devez tenir compte de la stabilité de votre protéine dans le temps dans le cadre de vos expériences. Ensuite, la stabilité (dans le temps ou peut-être la thermostabilité) peut être une caractéristique de votre enzyme que vous voudrez évaluer dans le cadre de votre recherche. Les changements de stabilité présentent souvent un intérêt et l’augmentation de la thermostabilité est généralement un résultat souhaité lors de la conception d’une enzyme. Premièrement, nous nous pencherons sur la stabilité pour ce qui est du maintien de l’intégrité de votre protéine. Vous exprimerez et purifierez votre protéine native dès la troisième semaine du semestre. Pensez-vous que cette protéine purifiée aura la même activité et se comportera de la même manière lors de vos dosages finaux de la semaine 9? Que pouvez-vous faire pour maintenir l’intégrité de vos protéines dans le temps? Un facteur essentiel à prendre en compte est la manière dont votre protéine est stockée; il est primordial de comprendre et de choisir les conditions dans lesquelles votre protéine peut être conservée sans perte appréciable d’activité pour pouvoir l’évaluer de manière efficace. Afin de maintenir une activité maximale et d’obtenir des résultats cohérents d’une période de laboratoire à l’autre, comment devez-vous stocker vos protéines? À quelle température? Dans un tampon? À quelle concentration? Comment devez-vous manipuler votre protéine lorsque vous l’utilisez? Si vous observez une perte d’activité avec le temps, qu’est-ce qui pourrait entraîner cette réduction d’activité? Que pourriez-vous faire pour atténuer la perte d’activité? Que pourriez-vous faire pour limiter l’effet de la perte d’activité de votre protéine dans le temps sur vos résultats? Outre la mesure de l’activité réduite, comment pourriez-vous détecter que l’intégrité de votre protéine diminue avec le temps? Par ailleurs, si vous souhaitez évaluer la stabilité de votre protéine en tant que caractéristique supplémentaire, comment pouvez-vous vous y prendre? Qu’est-ce qu’un dosage approprié et comment pouvez-vous tester votre enzyme? |
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Une fois les échantillons liés à la résine d’affinité métallique, les procédures de purification et de dessalage sont clairement décrites dans les manuels des fabricants respectifs. Pour préparer les culots cellulaires à se lier à la résine, les cellules seront passées dans le microfluidiseur Mehl Core Lab, puis les cellules lysées seront centrifugées. Une autre solution consiste à soniquer et à centrifuger les cellules conformément à la procédure générale décrite plus loin dans ce manuel. Notez que tout au long du processus de purification, les échantillons doivent être conservés sur de la glace afin d’éviter que les protéines les moins stables ne se déploient.
Parmi les trois types de culots cellulaires conservés à -80° C, purifiez au moins un culot de chaque type. Conservez les culots restants à -80°C. D’autres expressions de protéines peuvent être réalisées ultérieurement si nécessaire. Notez toutefois qu’un préavis d’au moins trois jours est nécessaire pour préparer des cultures de départ non inductives.
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À partir de votre solution de réserve 5x, préparez un tampon d’équilibrage 1x (50 mM de phosphate de sodium pH 7, 300 mM de NaCl) – vous aurez besoin d’environ 1 l au total pour la resuspension des cellules et le lavage du microfluidiseur entre les échantillons.
Placez les culots dans les tubes sur de la glace et resuspendez chacun d’eux complètement (pas de morceaux) dans 10 ml de solution d’équilibrage TALON 1x moins l’imidazole. Resuspendez un culot du type sauvage et un de chacune des deux protéines mutantes ncAA (semaine 3). Emmenez vos cellules resuspendues sur glace, votre flacon de tampon d’équilibrage 1X et vos tubes de centrifugation Oakridge au laboratoire central en ALS 2124. Votre auxiliaire à l’enseignement vous montrera comment utiliser le microfluidiseur. Nous enverrons les groupes un par un. Pour terminer l’expérience à temps, vous devrez effectuer la microfluidisation pendant la première heure de travaux pratiques. Les groupes ne seront pas autorisés à commencer la microfluidisation après la première heure. Vous devrez également avoir terminé d’éluer la protéine de la résine avant la fin de la période de travaux pratiques. Travaillez de manière efficace!
Une fois que vous avez récupéré vos cellules lysées, retournez au laboratoire d’enseignement BB et centrifugez vos échantillons dans le rotor Sorvall SS34 à 18 000 tours/minute pendant 20 minutes, à 4 °C. Veillez à bien équilibrer les tubes d’abord.
Préparation de la résine TALON et fixation de l’échantillon :
Pendant que les cellules microfluidisées centrifugent, préparez et lavez la résine d’affinité pour les métaux BD TALON, en suivant le protocole décrit dans le manuel TALON (spécifiquement le protocole concernant la purification du type sauvage à pH 7). Le manuel inclut également la quantité recommandée de volume de lit de résine à utiliser – anticipez qu’il y aura au moins 20 mg de protéine pour 100 ml de culture pour la protéine de type sauvage (la production varie en fonction de la stabilité de chaque protéine et de l’efficacité de la machinerie de traduction, donc chaque site TAG sera différent en fonction de son emplacement et des ncAA incorporés). Une fois que la résine a été lavée et combinée à l’échantillon dans un tube Falcon de 50 ml, liez l’échantillon à la résine pendant au moins 30 minutes (à température ambiante ou plus froide) par agitation. Une fois l’échantillon lié, il peut soit être lavé en lots ou être appliqué à la colonne et lavé abondamment (2 x 10 ml environ). Le degré de lavage peut être surveillé grâce à une coloration de Bradford Coomassie – si une couleur bleue apparaît lorsque 500 ml de coloration sont combinés avec 20 ml d’éluant, alors il est probable que des protéines sans étiquette poly-histidine soient encore en train d’être lavées de la résine. Lorsqu’aucune couleur bleue n’apparaît, éluez la protéine purifiée avec 1,5 à 2 ml de tampon d’élution. C’est un volume pratique à utiliser pour l’étape suivante, le dessalage.
Stockez les fractions de protéine éluée à 4 °C (pas congelées!) ou sur de la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à passer à l’étape suivante.
Pour dessaler l’échantillon de protéine dans le tampon de stockage, suivez la procédure décrite dans le manuel des colonnes de dessalage PD-10. Prévoyez environ 20 minutes pour laver la colonne de dessalage avec le tampon de stockage. Vous devrez peut-être le faire pendant la séance de laboratoire suivante.
Méthode de destruction des cellules par sonication (méthode de rechange) :
Placez les culots sur de la glace et ajoutez une quantité appropriée de tampon de lavage. Combinez tous les culots du même type protéique (c.-à-d. le type sauvage par opposition aux deux types de culots de protéines mutantes ncAA) dans un seul tube conique de 50 ml.
Une fois les culots combinés, ajoutez 20 mg de lysozyme (sans excéder une concentration totale en lysozyme de 1 mg/ml) aux cellules resuspendues. Mélangez le lysozyme dans la solution par inversion douce seulement – ne pas secouer, faire mousser (c.-à-d. en y incorporant de l’air) ou réchauffer les échantillons, la protéine pouvant être instable lorsqu’elle est exposée à l’air ou à la chaleur. Toute partie restante de culot peut être resuspendue par une brève sonication.
Pour lyser les cellules de manière plus complète, vous pouvez utiliser la sonication. La sonication rompt les parois des cellules à peu près de la même manière que le fait de se tenir près d’une enceinte à un concert peut rompre les tympans. Par conséquent, des protections auditives devront être portées pendant toute la durée de ce processus. Utilisez le réglage de puissance le plus élevé pour soniquer l’échantillon sans le faire mousser. Bouger l’extrémité du sonicateur près de la surface de la solution la fera mousser, et lui faire toucher le tube de plastique l’empêchera de lyser correctement les cellules. Ne faites pas de sonication dans un contenant en verre. La sonication de chaque échantillon pendant trois intervalles d’une minute devrait être suffisante. Ne laissez pas le sonicateur réchauffer l’échantillon à une température supérieure à la température ambiante – si l’échantillon commence à chauffer, arrêter la sonication jusqu’à ce qu’il soit refroidi.
Pour éliminer les débris cellulaires, les échantillons doivent être centrifugés vraiment rapidement dans des tubes conçus pour grandes vitesses munis de bouchons. Après vous être assuré que les tubes soient bien équilibrés dans le rotor (vérifiez avec une balance) et qu’ils ne soient pas fissurés ou que leur structure ne soit pas fragilisée, faites-les tourner aussi vite que la centrifugeuse le permet pendant 30 minutes.
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Matériel nécessaire
Détermination de la concentration en protéine
Déterminer l’activité et les constantes catalytiques de l’anhydrase carbonique et de la catalase
Le matériel variera selon les groupes en fonction de la nature du dosage. Chaque groupe a la responsabilité de veiller à ce que l’équipement et le matériel nécessaires à l’exécution de leur dosage soient disponibles d’une semaine à l’autre.
Ressources et protocoles suggérés
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La méthode permettant de générer une courbe étalon et de mesurer les concentrations d’échantillons est décrite clairement dans le manuel de dosage Bradford. Anticipez un intervalle de travail de 100 à 1 500 µg/ml de protéine. Des échantillons d’albumine sérique bovine étalonnée seront fournis.
Attention : La solution Bradford Coomassie est un acide très fort (acide phosphorique) – faites preuve d’une grande prudence lorsque vous l’utilisez et, en cas d’exposition, lavez immédiatement à l’eau claire. Recueillez le réactif usagé dans un contenant à déchets approprié dans la hotte de laboratoire.
Lorsque vous préparez et réalisez le gel SDS-PAGE de l’échantillon de protéine purifiée, la seule différence réside dans la préparation de l’échantillon. Environ 5 à 20 µl de l’échantillon de protéine dessalée peut être mélangé à 20 µl de SDS 2x, qui peut alors être chauffé à 100 °C pendant 5 à 10 minutes. Centrifugez brièvement les tubes afin que la totalité de l’échantillon se retrouve dans la partie inférieure du tube. 20 µl de ce mélange peuvent être ajoutés aux puits du gel. Une règle empirique pour les mini gels consiste à ajouter environ 0,5 microgramme de protéine par bande attendue, de manière à ce que le gel ne soit pas surchargé.
Réflexions approfondies sur la concentration de protéines Il existe de nombreuses manières permettant de mesure une concentration en protéine, et comme c’est souvent le cas, chacune a ses avantages et ses inconvénients. Comment mesurez-vous la concentration en protéine? Les réactifs pour un dosage Bradford sont fournis, mais vous devez quand même vous demander si c’est la meilleure méthode pour mesurer la concentration de votre protéine. Outre le dosage Bradford, deux des moyens les plus courants pour déterminer une concentration en protéine sont le dosage protéique BCA et l’absorbance à 280 nm en utilisant un Nanodrop ou un Picodrop. Différentes choses sont à prendre en considération lorsqu’on sélectionne une méthode : la compatibilité avec le type d’échantillon et les composants de la solution tampon (notamment le zinc ajouté), l’intervalle de dosage et le volume d’échantillon requis, la vitesse et la praticabilité par rapport au nombre d’échantillons à tester, la disponibilité d’un spectrophotomètre ou d’un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance par le dosage, l’utilité pour la mesure du lysat de cellule entière ou la protéine pure, l’uniformité (quelle variation y a-t-il d’une protéine à l’autre?) et si on l’utilise, l’adéquation de l’étalon. Dans le cas qui vous concerne, il faudra également prendre en compte l’effet que l’ajout d’un acide aminé non canonique à votre protéine pourrait avoir sur vos mesures. Le dosage Bradford se fonde sur la liaison proportionnelle de la coloration Coomassie aux protéines. Dans les limites de l’intervalle linéaire du dosage, plus il y a de protéines, plus la coloration Coomassie se lie, et plus la couleur devient foncée. La coloration Coomassie absorbe à 595 nm, donc en utilisant un étalon de protéine, le plus souvent l’albumine bovine sérique (BSA), vous pouvez générer une courbe étalon et l’utiliser pour mesurer les concentrations en protéine de vos échantillons. Le dosage protéique BCA est également un dosage colorimétrique utilisé pour quantifier une concentration en protéines. La méthode se base sur la réduction du cuivre et la détection consécutive du cuivre réduit par le BCA (acide bicinchoninique). Ce complexe cuivre/BCA présente une absorption linéaire forte à 562 nm avec des concentrations en protéines croissantes. Comme avec le dosage Bradford, un étalon de protéine, le plus souvent l’albumine bovine sérique, est utilisé pour générer une courbe étalon avec laquelle vous pourrez déterminer les concentrations en protéines de vos échantillons. Un Nanodrop est un spectrophotomètre de laboratoire courant qui peut être utilisé pour déterminer les concentrations en protéines, en ADN et en ARN. Pour mesurer une concentration en protéines, le Nanodrop utilise l’absorbance à 280 nm, souvent appelée A280, et un coefficient d’extinction pour déterminer la concentration d’un échantillon de protéine pure. Qu’est-ce qu’un coefficient d’extinction? Un coefficient d’extinction est une constante, pour une protéine, qui reflète la quantité de lumière ultraviolette qu’elle va absorber en fonction de sa composition en acides aminés, les acides aminés aromatiques étant les principaux responsables de l’absorption de la lumière ultraviolette. L’avantage du Nanodrop est qu’il ne nécessite que des échantillons de toute petite taille (~1-2 µl) et qu’il est rapide. |
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En bref, un dosage enzymatique consiste à prendre une enzyme et à la recombiner avec les matériaux de départ. Il est par conséquent nécessaire d’avoir un moyen de contrôler la disparition des matériaux de départ ou la formation des produits. Si l’enzyme augmente effectivement la vitesse de la réaction, alors la formation de produits sera notablement plus rapide avec l’enzyme que sans l’ajout de l’enzyme. Le catalyseur utilisé ici provenant d’un organisme vivant, il est sensible à la concentration en sel, au pH et aux concentrations des matériaux de départ et des produits. La littérature concernant la protéine peut fournir des données utiles à propos de ces valeurs.
Ne vous inquiétez pas lorsque vous commencez les dosages bruts initiaux – il est fort peu probable que cela semble juste au premier essai. Il existe trop de facteurs qui auront besoin d’être ajustés pour obtenir des données correctes. Lorsque vous commencez, laissez bien au dosage l’occasion de montrer une activité catalytique, sans perdre de temps avec la précision des mesures et l’élaboration de solutions de réserve.
Réflexions approfondies sur la cinétique et les dosages Vous comparerez au moins la cinétique de votre protéine native à celle des protéines mutantes ncAA au moyen d’un dosage. Mais que signifient en fait ces changements dans les paramètres cinétiques et comment interprétez-vous vos résultats? Interpréter vos résultats d’une manière significative est peut-être l’une des parties les plus difficiles de vos expériences. Revoyons tout d’abord certaines valeurs cinétiques fondamentales. KM est la constante de Michaelis et représente la concentration du substrat à 1/2 Vmax. Vmax est la vitesse maximale de l’enzyme. kcat est le nombre de rotations et mesure le nombre de molécules de substrat converties par molécule d’enzyme par seconde. Le rapport kcat/KM est souvent utilisé comme mesure de l’efficacité catalytique. Comment allez-vous obtenir ces valeurs (et peut-être d’autres) en vous servant de votre dosage cinétique? Nous supposons généralement que les enzymes suivent la cinétique de Michaelis-Menten, mais est-ce bien le cas pour votre enzyme? Quel est le modèle le plus adapté à la cinétique de votre enzyme et comment a-t-il été modélisé dans la littérature? Pour évaluer la cinétique de vos protéines, à quels moments et pendant combien de temps devez-vous prendre vos mesures? Quels autres facteurs devez-vous prendre en compte afin de réaliser un dosage cinétique précis et constant? Par exemple, quelle influence la température, le pH et la composition du tampon ont-ils sur votre dosage? Quelles variables doivent rester constantes, et quelles variables doivent changer à mesure que vous effectuez votre dosage? (Si votre enzyme suit la cinétique de Michaelis-Menten, la concentration de l’enzyme doit rester constante tandis que la concentration du substrat doit changer). Une fois que vous avez vos résultats, qu’en faites-vous? Comment pourriez-vous évaluer la précision et la validité de vos mesures? Vos résultats sont-ils cohérents entre eux et ont-ils un sens? Vous pourriez également réussir à trouver dans la littérature les paramètres cinétiques acceptables pour votre protéine native. Qu’est-ce qui vous permet d’établir une comparaison significative entre vos valeurs et celles trouvées dans la littérature? Que signifient les changements des divers paramètres cinétiques? |
Matériel nécessaire
Ressources et protocoles suggérés
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Bien que les spécificités des dosages varient en fonction de la protéine, il est recommandé de commencer par la solution de protéine de type sauvage la plus concentrée et des réactifs mesurés grossièrement. Il est de la plus grande importance de réaliser des solutions de réserve et de noter l’ordre dans lequel les composants sont mélangés. Il est prudent de conserver des solutions de réserve de chaque composant jusqu’à ce que le comportement de chacun d’entre eux soit connu (Est-il sensible à la température? Précipite-t-il avec le temps? Détruit-il la protéine? Ou ne dure-t-il que le temps d’un cours?). Le mélange des réactifs dans une seule grande solution de réserve au début de la réalisation des dosages sacrifie une grande partie du contrôle que l’on a sur l’expérience.
Voici quelques conseils pour trouver une méthode de dosage reproductible :
Remarque : l’exemple qui suit n’est pas un dosage approprié pour vos enzymes, il s’agit simplement un exemple d’un dosage pouvant être suivi au moyen d’un spectrophotomètre!
Voici un exemple d’une réaction de dosage enzymatique pour 1 ml nécessitant un ion Zn2+. Une solution de réserve concentrée 10x de tous les composants (dissous dans un tampon de dosage) peut être réalisée.
Placez 780 ml de tampon de dosage dans une cuvette (conservé à température ambiante).
Ajoutez 100 ml de solution de ZnCl2 (10x, dans un tampon de dosage) (conservée à la température nécessaire).
Ajoutez 100 ml de solution de substrat (10x, dans un tampon de dosage) (conservée à la température nécessaire).
Mélangez.
Placez la cuvette dans l’instrument et réglez le zéro. Il peut être utile de faire exécuter à l’instrument une collecte de données complète pour voir ce qui se passe. Rien ne devrait se passer, puisque l’enzyme n’a pas encore été ajoutée. Si quelque chose change, c’est la réaction de base et il est important de la surveiller.
Ajoutez 20 ml de la solution la plus concentrée d’enzyme de type sauvage (conservée sur de la glace).
Mélangez rapidement par pipetage à l’aide d’une pipette P1000.
Recueillez les données.
Y a-t-il une activité? Oui! Gardez à l’esprit qu’il vous faudra effectuer une réaction de contrôle sans enzyme pour vous assurer que les données semblent différentes.
À présent, modifiez le dosage de manière à ce que toutes les constantes cinétiques nécessaires à la publication puissent être rassemblées et que les enzymes mutantes ncAA puissent être testées. Il peut être utile de peaufiner le dosage avant de prendre les mesures pour de bon; il est bon de décrire certains aspects, tels que le contrôle de la température et la prise de données en triple exemplaire pour les barres d’erreur, avant de prendre une série de mesures pour toutes les enzymes.
Réflexions approfondies sur « Comment écrire un bon article? De quoi ai-je besoin pour être publié? » D’ici la fin de ce trimestre, avec un peu de chance, vous aurez été exposé à un corpus significatif de littérature concernant la protéine qui vous intéresse. À présent, il vous faut préparer votre recherche dans un manuscrit. Pensez à certains des articles que vous avez lus. Qu’avez-vous apprécié dans ces articles? Qu’est-ce que vous n’avez pas aimé? Peut-être aimez-vous que les auteurs racontent une histoire qui capte votre attention, ou que les données soient présentées de manière claire et concise. Vous pouvez vous servir de votre expérience de lecteur pour guider votre rédaction. Outre le fait de créer un manuscrit agréable à lire, il est important de prendre en compte l’utilité et la fiabilité de votre travail. Tout comme vous l’avez fait au début de ce trimestre, lorsqu’ils se lancent dans un nouveau projet, lorsqu’ils abordent un nouveau domaine de recherche ou qu’ils étudient une nouvelle technique, les scientifiques ont tendance à examiner la littérature existante pour voir ce qui a été fait et ce qui est déjà connu. À ce titre, il est important que ces articles incluent les renseignements nécessaires pour répéter ces expériences et répliquer les résultats. Le lecteur voudra également être capable d’évaluer la qualité et le sens de votre travail. Pour un travail comme un dosage cinétique, il est important de réaliser de multiples essais (dans l’idéal, trois) et d’inclure les barres d’erreur. Cela lui permet de décider si vos résultats sont dus au hasard ou s’ils sont constants et significatifs. |
1
Avant de commencer un travail de laboratoire, quel qu’il soit, il est important de vérifier la précision des micropipettes qui seront utilisées tout au long du semestre. L’eau est un moyen très simple d’y parvenir, puisqu’elle a une densité de 1 kg/litre. Par conséquent, en enregistrant les poids de différents volumes d’eau, il est facile et rapide d’évaluer la précision de la pipette, compte tenu de la fiabilité de la balance.
Utilisez le protocole ci-dessous pour remplir le tableau suivant pour chaque pipette :
Micropipette no _______ Volume maximum de la micropipette : _____ ml
Paramètre de volume : _____ ml (max) Paramètre de volume : _____ ml (1/4 max)
Masse d’H2O distillée (mg) Masse d’H2O distillée (mg)
______ ______
______ ______
______ ______
______ ______
______ ______
2
Des versions électroniques de ces séquences sont disponibles sur Canvas.
CA | Gène de la variante thermostable de l’anhydrase carbonique II humaine
Gène avec sites TAG disponibles (en gras et soulignés – Phe20, Phe93, Trp97, Lys126, Glu186, et Glu233), 6his-tag (en minuscules), et mutations thermostables (en minuscules) |
ATGGCGCATCATTGGGGTTACGGTAAACACAACGGTCCGGAGCATTGGCAC-AAAGATTTTCCAATTGCGAAGGGCGAACGTCAAAGCCCGGTTGACATTGAT-ACGCACACGGCAAAGTACGACCCGAGCCTGAAACCGCTGAGCGTTTCCTAT-GACCAGGCTACGAGCCTGCGTATCCTGAACAATGGCCACaccTTCAACGTGG-AGTTTGATGATTCCCAAGATAAGGCGGTTCTGAAAGGTGGTCCGTTGGATG-GCACCTACCGCCTGATCCAATTTCACTTTCACTGGGGTAGCcacGACGGTCA-GGGCAGCGAGCATACCGTGGACAAAAAGAAGTATGCAGCCGAACTGCACCT-GGTGCATTGGAACACGAAGTACGGCGACTTCGGTAAAGCGGTCCAGCAACC-GGACGGTCTGGCTGTTCTGGGTATTTTCCTGAAGGTCGGCAGCGCGaacCCG-GGTCTGCAGAAAGTGGTTGACGTGTTGGACTCTATCAAGACCAAAGGCAAGA-GCGCGGACTTCACCAATTTCGATCCGCGTGGTCTGCTGCCGGAGAGCCTGGA-TTACTGGACTTATCCGGGCAGCCTGACCACCCCGCCATTGCTGGAGTGCGTG-ACCTGGATCGTCTTGAAAGAACCGATCAGCGTTAGCTCTGAACAGGTCagcAA-GTTCCGCAAGCTGAATTTCAATGGTGAGGGCGAGCCGGAAGAAccgATGGTC-GATAATTGGCGTCCTaccCAACCGCTGAAAAACCGCCAGATTAAAGCATCCTTTA-AGcatcaccaccaccatcactaa
|
Mutations visant à augmenter la thermostabilité | A65T, L100H, K153N, L223S, L239P, A247T |
HPII | Gène de la catalase HPII d’E. coli
Gène avec 6his-tag et sites tags disponibles (en gras et soulignés – Phe206, Glu283, Lys348, His392, Tyr415, et Asp568) et 6his-tag avec séquence de liaison (en minuscules) |
atggggggttctcatcatcatcatcatcatggtatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcggga-
tctgtacgacgatgacgataaggatcgatggggatccgagctcgagTCGCAACATAACGAAAAG-AACCCACATCAGCACCAGTCACCACTACACGATTCCAGCGAAGCGAAACCGG-GGATGGACTCACTGGCACCTGAGGACGGCTCTCATCGTCCAGCGGCTGAACC-AACACCGCCAGGTGCACAACCTACCGCCCCAGGGAGCCTGAAAGCCCCTGAT-ACGCGTAACGAAAAACTTAATTCTCTGGAAGACGTACGCAAAGGCAGTGAAAA-TTATGCGCTGACCACTAATCAGGGCGTGCGCATCGCCGACGATCAAAACTCAC-TGCGTGCCGGTAGCCGTGGTCCAACGCTGCTGGAAGATTTTATTCTGCGCGAG-AAAATCACCCACTTTGACCATGAGCGCATTCCGGAACGTATTGTTCATGCACGC-GGATCAGCCGCTCACGGTTATTTCCAGCCATATAAAAGCTTAAGCGATATTACC-AAAGCGGATTTCCTCTCAGATCCGAACAAAATCACCCCAGTATTTGTACGTTTCT-CTACCGTTCAGGGTGGTGCTGGCTCTGCTGATACCGTGCGTGATATCCGTGGC-TTTGCCACCAAGTTCTATACCGAAGAGGGTATTTTTGACCTCGTTGGCAATAACA-CGCCAATCTTCTTTATCCAGGATGCGCATAAATTCCCCGATTTTGTTCATGCGGT-AAAACCAGAACCGCACTGGGCAATTCCACAAGGGCAAAGTGCCCACGATACTTTC-TGGGATTATGTTTCTCTGCAACCTGAAACTCTGCACAACGTGATGTGGGCGATGT-CGGATCGCGGCATCCCCCGCAGTTACCGCACCATGGAAGGCTTCGGTATTCACAC-CTTCCGCCTGATTAATGCCGAAGGGAAGGCAACGTTTGTACGTTTCCACTGGAAAC-CACTGGCAGGTAAAGCCTCACTCGTTTGGGATGAAGCACAAAAACTCACCGGACGT-GACCCGGACTTCCACCGCCGCGAGTTGTGGGAAGCCATTGAAGCAGGCGATTTTCC-GGAATACGAACTGGGCTTCCAGTTGATTCCTGAAGAAGATGAATTCAAGTTCGACTT-CGATCTTCTCGATCCAACCAAACTTATCCCGGAAGAACTGGTGCCCGTTCAGCGTGT-CGGCAAAATGGTGCTCAATCGCAACCCGGATAACTTCTTTGCTGAAAACGAACAGGC-GGCTTTCCATCCTGGGCATATCGTGCCGGGACTGGACTTCACCAACGATCCGCTGTT-GCAGGGACGTTTGTTCTCCTATACCGATACACAAATCAGTCGTCTTGGTGGGCCGAAT-TTCCATGAGATTCCGATTAACCGTCCGACCTGCCCTTACCATAATTTCCAGCGTGAC-GGCATGCATCGCATGGGGATCGACACTAACCCGGCGAATTACGAACCGAACTCGATT-AACGATAACTGGCCGCGCGAAACACCGCCGGGGCCGAAACGCGGCGGTTTTGAATC-ATACCAGGAGCGCGTGGAAGGCAATAAAGTTCGCGAGCGCAGCCCATCGTTTGGCGA-ATATTATTCCCATCCGCGTCTGTTCTGGCTAAGTCAGACGCCATTTGAGCAGCGCCATA-TTGTCGATGGTTTCAGTTTTGAGTTAAGCAAAGTCGTTCGTCCGTATATTCGTGAGCG-CGTTGTTGACCAGCTGGCGCATATTGATCTCACTCTGGCCCAGGCGGTGGCGAAAAAT-CTCGGTATCGAACTGACTGACGACCAGCTGAATATCACCCCACCTCCGGACGTCAACG-GTCTGAAAAAGGATCCATCCTTAAGTTTGTACGCCATTCCTGACGGTGATGTGAAAGGT-CGCGTGGTAGCGATTTTACTTAATGATGAAGTGAGATCGGCAGACCTTCTGGCCATTCT-CAAGGCGCTGAAGGCCAAAGGCGTTCATGCCAAACTGCTCTACTCCCGAATGGGTGAA-GTGACTGCGGATGACGGTACGGTGTTGCCTATAGCCGCTACCTTTGCCGGTGCACCTT-CGCTGACGGTCGATGCGGTCATTGTCCCTTGCGGCAATATCGCGGATATCGCTGACAA-CGGCGATGCCAACTACTACCTGATGGAAGCCTACAAACACCTTAAACCGATTGCGCTG-GCGGGTGACGCGCGCAAGTTTAAAGCAACAATCAAGATCGCTGACCAGGGTGAAGAAG-GGATTGTGGAAGCTGACAGCGCTGACGGTAGTTTTATGGATGAACTGCTAACGCTGATG-GCAGCACACCGCGTGTGGTCACGCATTCCTAAGATTGACAAAATTCCTGCCTGA
|
3
(Remarque : toutes les structures ne sont pas disponibles pour chaque site de chaque enzyme)
4
Milieu non inductif pour cultures de départ
Lors de l’inoculation du milieu à auto-induction par les cellules, il est possible d’utiliser des cultures de départ saturées dans un milieu riche (c.-à-d. des cellules saturées dans un bouillon 2XYT). Cependant, il est également possible d’utiliser des cultures de départ saturées cultivées dans un milieu non inductif, qui sont stables pendant une période beaucoup plus longue lorsqu’elles sont conservées à 4 °C (jusqu’à une semaine, voire au-delà). Pour fabriquer 1 litre de milieu non inductif, suivez les instructions ci-dessous.
Milieu non inductif pour cultures de départ (1 l)
Aspartate (5 %, pH 7,5) 50 ml
Sels minéraux (25 x) 40 ml
Glucose (40 %) 12,5 ml
MgSO4 (1 M) 2 ml
Métaux traces (5 000 x) 200 ml
Mélange de 18 AA (25 x) (à 4°C) 40 ml (pour une croissance plus rapide de la culture de départ)
Ajoutez les antibiotiques appropriés (ampicilline à une concentration finale de 100 mg/ml et tétracycline à 25 mg/ml).
Ajoutez de l’eau stérile pour obtenir un volume final de 1 l.
Environ 4 à 5 ml de milieu non inductif suffit pour un milieu de départ d’une culture cellulaire spécifique. Inoculez ce volume de milieu de départ non inductif avec 40 à 50 ml de 2XYT saturé ou autre culture de départ en milieu saturé.
Milieu à auto-induction pour les expressions
Pour fabriquer 100 ml de milieu à auto-induction (AIM), suivez les instructions ci-dessous.
Ajustez la quantité à fabriquer nécessaire à votre expérience en fonction des quantités suivantes pour 100 ml. Préparez un mélange frais et ne prévoyez pas de stocker le milieu à auto-induction en excès.
Aspartate (5 %, pH 7,5) 5 ml
Glycérol (10 %) 5 ml
Sels minéraux (25x) 4 ml
Glucose (40 %) 0,125 ml
MgSO4 (1 M) 0,2 ml
Arabinose (20 %) 0,25 ml
Métaux traces (5 000x) 20 ml
Mélange de 18 AA (25x) conservé à 4 °C 4 ml
Ajoutez les antibiotiques appropriés (ampicilline à une concentration finale de 100 mg/ml et tétracycline à 25 mg/ml).
Ajoutez de l’eau stérile pour obtenir un volume final de 100 ml.
5
Équipement général de laboratoire
Équipement à usage minimal
Groupe
Tiroirs, étagères et placards communs ou paillasse de fournitures
Produits chimiques (Spécialités, il est possible de substituer les fournisseurs)
Produits chimiques préparés
6
Plasmides d’expression disponibles | Protéine encodée | Résistance aux antibiotiques | Identifiant Addgene |
pBad CA natif | CA thermostable de type sauvage | ampicilline | 105665 |
pBad CA TAG20 | CA thermostable TAG20 | ampicilline | 105666 |
pBad CA TAG93 | CA thermostable TAG93 | ampicilline | 105667 |
pBad CA TAG97 | CA thermostable TAG97 | ampicilline | 105668 |
pBad CA TAG126 | CA thermostable TAG126 | ampicilline | 105836 |
pBad CA TAG186 | CA thermostable TAG186 | ampicilline | 105837 |
pBad CA TAG233 | CA thermostable TAG233 | ampicilline | 105838 |
pBad HPII natif | Catalase HPII de type sauvage | ampicilline | 105839 |
pBad HPII TAG206 | Catalase HPII TAG206 | ampicilline | 105846 |
pBad HPII TAG392 | Catalase HPII TAG392 | ampicilline | 105848 |
pBad HPII TAG415 | Catalase HPII TAG415 | ampicilline | 105847 |
pBad HPII TAG568 | Catalase HPII TAG568 | ampicilline | 105845 |
pBad HPII TAG283 | Catalase HPII TAG283 | ampicilline | 105843 |
pBad HPII TAG348 | Catalase HPII TAG348 | ampicilline | 105844 |
pBad sfGFP | sfGFP | ampicilline | 85482 |
pBad sfGFP TAG150 | sfGFP TAG150 | ampicilline | 85483 |
CA : anhydrase carbonique II humaine thermostable
HPII : catalase HPII d’E. coli
sfGFP: superfolder green fluorescent protein (protéine fluorescente verte superfolder)
Enzyme | Site d’insertion de TAG | ncAA pour incorporation |
CA
Humaine thermostable |
F20 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y |
F93 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y | |
W97 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y | |
K126 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y | |
E186 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y | |
E233 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y | |
HPII
E. coli |
F206 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y |
E283 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y | |
K348 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y | |
H392 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y | |
Y415 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y | |
D568 | 3-NY, pAzF, p-NO2F, pBrF, pAF, pIF, O-CH3Y |
Plasmide GCE | Machinerie moléculaire | ncAA compatibles pour incorporation | Résistance aux antibiotiques | Identifiant Addgene |
pDule-para-aminoPhe | pAF | pAF | tétracycline | 85502 |
pDule-3-nitrotyrosine | NitroY | 3-NY | tétracycline | 85498 |
pDule-pCNF | pCNF | pAzF, p-NO2F, pBrF, pIF, O-CH3Y | tétracycline | 85494 |
Abréviations des ncAA :
7
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